Artículo: Determination of glycosidase activity in porcine oviductal fluid at the different phases of the estrous cycle

Publicado en: REPRODUCTION, Volumen: 136 Nº: 6 Páginas: 833-842 Fecha: DIC 2008  

Autores: Raquel Romar, Luis César Carrasco, Manuel Avilés, Joaquín Gadea y Pilar Coy.

La relevancia de la composición del fluido oviductal

En condiciones fisiológicas, el proceso de fecundación tiene lugar en el aparato genital femenino concretamente en el oviducto (denominado trompas de Falopio en la especie humana). Aquí es donde se encontrarán los gametos masculino (espermatozoide) y femenino (ovocito) para, tras la fecundación, dar lugar a un embrión. El oviducto tiene forma de tubo y una longitud que varía según la especie y la edad de la hembra. Su interior está repleto de un medio más o menos líquido que, en parte, procede de la secreción de las propias células oviductales. Este medio se llama fluido oviductal (FO) y conocer su composición tiene una gran importancia en el campo de la Biología de la Reproducción ya que este fluido es el “medio de cultivo” fisiológico con el que los gametos interaccionan antes y durante la fecundación, y en el que tendrá lugar incluso el desarrollo embrionario temprano. Como casi cualquier otro fluido biológico, el FO tiene en su composición aminoácidos, iones, carbohidratos, proteínas,… Esta composición no es siempre la misma sino que se sabe que varía a lo largo del ciclo estral de la hembra. Es decir, cuando la hembra está en celo, y por lo tanto en el momento cercano a la ovulación (fase folicular del ciclo), la composición del FO no es la misma que cuando la hembra ya ha ovulado (fase luteal del ciclo). Esto permite proporcionar a los gametos, cigotos y embriones las condiciones óptimas para realizar su función y mantener su viabilidad.

Conocer la composición de este fluido y sus variaciones a lo largo del ciclo estral de la hembra es de gran importancia ya que, entre otras cosas, nos permitiría modificar y ajustar los medios de cultivo que se emplean in vitro para poder adaptarlos a lo que los gametos encuentran en condiciones fisiológicas. Somos muchos los científicos que pensamos que si “imitáramos” las condiciones naturales en la formulación de los medios de cultivo, mejoraríamos los resultados que se obtienen en el laboratorio y aumentaríamos la eficacia de muchas técnicas, entre ellas la fecundación in vitro, que desgraciadamente hoy en día sigue siendo poco eficiente.

Desarrollo de un método para la recogida del fluido oviductal

A pesar de la importancia que tiene conocer la composición y variación del FO, no existen muchos estudios que la aborden debido fundamentalmente a la dificultad que presenta la obtención de este fluido, sobre todo por la baja cantidad de FO que se obtiene de cada animal. Por ello, en nuestro laboratorio hemos desarrollado un método de recogida de FO a partir de oviductos obtenidos de animales sacrificados en el matadero que nos permite obtener cantidades suficientes para realizar estudios sobre su composición. El método consiste en aislar por completo el oviducto del tejido que lo rodea, introducir una pipeta automática por un extremo y presionar las paredes oviductales en dirección ascendente para recoger el fluido acumulado mediante aspiración con la pipeta introducida (Figura 1).

El papel de las glicosidasas en el proceso de reproducción

Una vez disponemos del FO, de todos los parámetros que podíamos analizar relacionados con su composición, nos planteamos estudiar si en el FO había enzimas tipo glicosidasa que tuvieran actividad. El hecho de decidirnos a estudiar estas enzimas se basa en que está bien documentado que los carbohidratos desempeñan un papel importante en diferentes momentos del proceso reproductivo como por ejemplo el reconocimiento espermatozoide-ovocito. La importancia de moléculas que contienen carbohidratos, como las glicoproteínas, glicolípidos y glicosaminoglicanos presentes en las superficies celulares, le da la opción a las glicosidasas presentes en el FO de desempeñar potenciales funciones en el proceso de reproducción ya que estas enzimas catalizan la hidrólisis de las cadenas de oligosacáridos pudiendo modificar por tanto las interacciones entre células.

Objetivo, metodología y resultados

En este trabajo investigamos las variaciones a lo largo del ciclo estral de la actividad enzimática de 7 exoglicosidasas: α-L-fucosidasa, β-N-acetil-glucosaminidasa, β-D-galactosidasa, α-D-galactosidasa, α-D-manosidasa, β-N-acetil-galactosaminidasa, y N-acetil-neuraminidasa. Además estudiamos la cantidad de proteínas y el volumen de FO bovino obtenido con el método de aspiración descrito. Observando la morfología de los ovarios adheridos a su propio oviducto, las muestras se clasificaron como foliculares (tempranas y tardías) o luteales (tempranas y tardías).

El FO que obtenemos se centrifuga (7.000g, 10 minutos, 4ºC), descartando los pequeños sedimentos celulares y midiendo el volumen del sobrenadante para calcular con posterioridad el volumen medio de FO obtenido por oviducto en cada una de las muestras y fases del ciclo estral. Las muestras se almacenan (-80ºC) para su posterior análisis enzimático y proteico. La actividad enzimática del FO se determina mediante la fluorescencia (340nm excitación, 450nm emisión) emitida por la liberación de derivados del sustrato 4’metilumbeliferil utilizado para cada una de las enzimas: α-L-fucósido, β-N-acetil-glucosamínido, β-D-galactósido, α-D-galactósido, α-D-manósido, β-N-acetil-galactosamínido y N-acetil-neuramínico. La concentración de proteínas de las secreciones oviductales se valora utilizando el ensayo del ácido bicinconínico mediante absorbancia (560nm) y utilizando albúmina sérica como estándar. Definimos 1 Unidad de actividad enzimática (AE) como la cantidad de enzima necesaria para hidrolizar 1pmol de sustrato (4’metilumbeliferil-glicósido)/minuto a 37ºC y pH=7, y la actividad enzimática específica (AEE) como el cociente entre AE y la concentración de proteínas de la muestra.

Los resultados del ensayo enzimático en más de 200 muestras de FO demostraron que existe actividad α-L-fucosidasa, β-N-acetil-glucosaminidasa, β-D-galactosidasa, α-D-manosidasa, y β-N-acetil-galactosaminidasa; pero no actividad α-D-galactosidasa ni neuraminidasa. Las enzimas α-L-fucosidasa y β-N-acetil-glucosaminidasa incrementaron su actividad en la fase folicular tardía para inmediatamente descender después de la ovulación (fase luteal); mientras que β-D-galactosidasa, α-D-manosidasa y β-N-acetil-galactosaminidasa mostraron su actividad más alta al inicio del ciclo (fase folicular temprana) para descender tras la ovulación (Figura 3). Los resultados del análisis de proteínas y de volumen mostraron igualmente que ambos parámetros aumentan significativamente justo antes de que el animal ovule, es decir en la fase folicular tardía (Tabla 1).

Estos resultados demuestran que el FO posee enzimas con actividad glicolítica y por tanto que estas enzimas podrían participar en la remodelación y cambio de los carbohidratos, aunque el papel exacto que ejercen estas enzimas en el proceso reproductivo debe ser demostrado en futuras investigaciones. Así, por ejemplo la α-L-fucosidasa podría intervenir en la liberación de espermatozoides unidos a las células epiteliales del oviducto ya que se sabe que los espermatozoides de cerdo se unen a estas células gracias a un ligando que poseen que contiene residuos de fucosa. Por su parte, la β-N-acetil-glucosaminidasa oviductal podría ayudar a dispersar las células que rodean al ovocito (células del cúmulus) una vez éste ha sido ovulado, facilitando así el contacto del espermatozoide con el ovocito.

Así pues, el hallazgo de que el FO tiene glicosidasas activas abre una nueva vía de investigación en la que deberemos comprobar qué papel ejercen estas enzimas y en qué pasos del complejo fenómeno de la fecundación intervienen. Igualmente, se pueden diseñar medios de cultivo in vitro en los que estén presentes estas enzimas a las concentraciones en las que las hemos detectado y así “simular” las condiciones que los gametos encuentran in vivo para poder estudiar si se unen más o menos espermatozoides al ovocito, o si entran más o menos espermatozoides al interior del gameto femenino, etc.